第128期糖類的分離純化及HPLC檢測

2020年03月17日來源：管理員

Part one 多糖

多糖（Polysacharides，PS），又稱多聚糖，是由10個以上的單糖通過苷鍵連接而成的，具有廣泛生物活性的天然大分子化合物。它廣泛分布于自然界高等植物、藻類、微生物（細菌和真菌）與動物體內。20世紀60年代以來，人們逐漸發現多糖具有復雜的、多方面的生物活性和功能：

(1) 多糖可作為廣譜免疫促進劑，具有免疫調節功能，能治療風濕病、慢性病毒性肝炎、癌癥等免疫系統疾病，甚至能抗AIDS病毒。如甘草多糖具有明顯的抗病毒和抗腫瘤作用，黑木耳多糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強人體免疫功能。

(2) 多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促進核酸與蛋白質的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗輻射，增強免疫功能等生物學作用，麥冬多糖具有降血糖及免疫增強作用，動物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能。

(3) 多糖能控制細胞分裂和分化，調節細胞的生長與衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用，銀杏外種皮粗多糖具有抗衰老、抗過敏、降血脂、止咳祛痰、減肥等功能。

一、粗多糖的制備

生物體中的多糖，通過用熱水提取，乙醇沉淀，色素和蛋白的去除，最終獲得精制的粗多糖，下邊是對關于精制粗多糖的具體介紹。

1.1? 多糖的提取

表1 顯示的是從真菌、藻類和高等植物中提取制備粗多糖的過程。總體而言，從真菌、藻類和植物中提取多糖的方法以水提法為主，也有采用酶解的方法進行提取，但是還是存在一些差異。對于真菌而言，需要先發酵，然后用不同溫度的熱水進行提取。對于植物，則根據提取部位不同，如根、莖、葉、果皮、果肉、種子或整個植物，方法略有差異。比如從莖、葉子、果皮和整棵植株中提取多糖，由于這些部位常含有色素和一些脂類物質，所以在提取前，常會選擇用乙醇、丙酮、甲醇或石油醚進行預處理，以便除去一些脂類、色素和小分子物質，然后再用熱水進行提取。相比而言，果肉和根部所含色素等小分子物質較少，則常常直接用髙溫的水進行提取。對于藻類，因其中也會含有不同類型的色素，也會先用有機溶劑去除色素和小分子物質，然后再用熱水進行提取。表1顯示真菌、藻類和高等植物的多糖的沉淀劑大多是乙醇，也有個別采用丙酮。

表1 粗糖的制備

屬類	研究對象	粗糖的制備
真菌	大杯香菇	熱水提取→Sevag法去除蛋白→乙醇沉淀→冷凍干燥
	冬蟲夏草	熱水提取→乙醇沉淀→活性炭去色素→Sevag法去除蛋白 →乙醇沉淀→冷凍干燥
	杏鮑菇	沸水提取→乙醇沉淀→冷凍干燥
植物	荷葉	95%乙醇去除小分子→沸水提取→乙醇沉淀 →Sevag法去除蛋白→冷凍干燥
	心葉青牛膽	甲醇去除小分子→丙酮沉淀→三氯乙酸去除蛋白
	石斛粉末	丙酮和甲醇去除小分子→熱水提取→乙醇沉淀
	荔枝果肉	乙醇去除小分子→熱水提取→乙醇沉淀→冷凍干燥
	龍葵	石油醚和乙醇去除小分子→蒸餾水提取→乙醇沉淀
藻類	海帶	石油醚去除小分子→熱水提取→乙醇沉淀 →Sevag法去除蛋白→透析→冷凍干燥
動物	烏賊墨汁	上清液用木瓜蛋白酶酶解蛋白→沸水使酶失活 →Sevag法去除蛋白→乙醇沉淀

1.1? 多糖中雜質的去除

粗多糖中往往混雜著蛋白質、色素、低聚糖等雜質，必須分別除去。

1.1.1????????? 蛋白質的去除

去除蛋白質常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶解法等。其中以Sevag法最常用，Sevag試劑是由一定比例的氯仿和正丁醇試劑組成，通常選擇氯仿:正丁醇＝4:1（v/v）。為了將蛋白盡可能多的去除，往往需要數次重復操作。另外，該方法很難將結合蛋白去除，往往是除去蛋白的同時，多糖也損失掉了。因而采用Sevag法去除蛋白存在以下幾個缺點：（1）有機試劑用量大；（2）試劑毒性大，污染嚴重；（3）效率低等缺點。近年，有些研究者采用酶解和經典方法相結合來去除蛋白，該方法是在提取的過程中先加入合適的蛋白酶，將蛋白和多糖分離開，再采用Sevag法去除蛋白，該方法既提高了多糖的提取率，又減少了有機溶劑的使用。

1.1.2????????? 色素的去除

從生物體內提取的多糖，尤其是從植物的莖、葉和果皮中提取的多糖往往含有大量的色素，這些色素嚴重影響著多糖的品質。目前，去除這些色素的的方法主要有三種：（1）通過柱層析的方法進行去除色素，例如大孔樹脂羅門哈斯的FPA98Cl。（2）通過吸附法去除色素，例如活性炭。（3）通過氧化法去除色素，例如低濃度的H₂O₂。

1.1.3????????? 小分子的去除

??? 盡管在從生物體中提取多糖時，很多研究者選擇用乙醇、丙酮、甲醇或石油醚進行預處理，但是經過乙醇沉淀，蛋白和色素的去除后，多糖中依然存在很多小分子，尤其是一些無機鹽、單糖和寡糖。對于無機鹽、單糖和寡糖等小分子物質，可以采用透析法、超濾法等去除。

二、多糖的分離和純化

經過前期對多糖的提取，去除蛋白質、色素、小分子等物質得到粗多糖，而這些粗多糖其實是由很多分子量、結構不同的多糖混合而成。為了得到純的多糖即均一性多糖，仍需進一步對這些粗多糖進行分離純化。

2.1 分步沉淀法

多糖的結構和分子量不同，其極性大小不同，在有機溶劑（如醇或酮）中的溶解度不同，根據這一原理，可以依此增加醇濃度，從而將多糖按分子量從大到小的沉淀出來。但是分級沉淀法一般得不到均一性多糖。仍需要借助柱層析法等進一步純化，方可得到均一性的多糖。

2.2 柱層析法

要獲得均一性的多糖，一般是先經過陰離子交換柱進行粗步純化，然后再用凝膠柱進一步純化。有些多糖也采用大孔樹脂柱進行純化。下面對這三種柱層析法進行詳細介紹。

2.2.1 陰離子交換法

一般使用陰離子交換柱對真菌、藻類和高等植物的多糖進行初步分離。陰離子交換色譜常用的介質有DEAE-纖維素、DEAE-瓊脂糖凝膠、DEAE-葡萄糖凝膠。最常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。例如用DEAE-52柱對大杯香菇等菌類、玉米等植物、桑黃等藻類粗多糖進行分離純化。使用DEAE-52填料進行多糖的初步分離純化，該柱子一般直徑偏大，其中以2.6cm最多，操作過程中流動相的流速也較快，流速一般在0.7-2ml/min之間，以1ml/min最多，至于柱子的長度，選擇范圍較廣，從25-100cm不等。DEAE-Sepharose柱也常被用在對菌類、植物和藻類粗多糖的初步分離純化中，在選擇層析柱的直徑、流速和長度的方面與DEAE-52相似。DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流動相都是純水和不同濃度的NaCl溶液。

2.2.2 凝膠色譜法

凝膠色譜法根據被分離組分尺寸大小與凝膠的孔徑關系實現分離，類似于分子篩的作用。常用的凝膠有葡聚糖凝膠（Sephadex?G）、Sephadex LH-20、聚丙烯酸凝膠Toyopearl HW等。多糖的進一步分離往往會選擇用各種凝膠進行分離純化。選擇使用哪一種凝膠對多糖進行純化的標準是多糖的分子量，不同種類和型號的凝膠能夠分離多糖類型和分子量范圍不同。凝膠柱的柱子規格常具有長而細的特點，直徑以1.6cm偏多。無論什么類型的凝膠柱，流動相多為蒸餾水或者一定濃度的NaCl溶液。

東曹的Toyopearl HW填料骨架為含羥基的親水性聚甲基丙烯酸樹脂，由于不含糖基，與其他做多糖的填料相比，不會和糖類樣品發生非特異性相互作用。

2.2.3 大孔樹脂柱色譜

大孔樹脂柱色譜是利用大孔樹脂的選擇性吸附作用和分子篩作用分離純化多糖。比如用AB-8大孔樹脂從青錢柳葉中分離純化出均一性多糖。

2.3 超濾法

超濾是以壓力為推動力的膜分離技術，應用膜分離原理將小分子溶質和溶劑除去而留下大分子溶質，從而使大分子物質得到純化。

表2 粗糖的進一步分離純化

屬類	對象	填料	流動相	獲得的多糖
真菌	大杯香菇粗多糖	DEAE-52(2.6×30cm) → Sephadex G-100(2.6×60cm)	H₂O, 0.3,0.45M NaCl→ 0.1M NaCl	均一性多糖LGPS-1
真菌	杏鮑菇粗多糖	DEAE-52(2.6×40cm) → Sephadex G-100 (1.3×50cm)	H₂O，0.2,0.3,0.5M NaCl →H₂O	均一性多糖IPS-1和IPS-2
植物	荷葉粗多糖	DEAE-52(2.5×50cm) → Sephadex CL-6B (2.5×100cm)	H₂O → 0.1M NaCl	均一性多糖LLP
植物	荔枝果肉粗糖	DEAE-52(2.6×60cm) → Sephadex G-100 (2.0×40cm)	H₂O，0.1,0.2,0.3M NaCl →H₂O	均一性多糖 LP1,LP2,LP3
藻類	桑黃粗多糖	DEAE Sepharose FF(2.6×40cm) → Sephacryl S-400 HR (1.5×60cm)	0-0.2M NaCl →H₂O	均一性多糖 PL-A11

三、多糖的HPLC分析

通常情況下，使用尺寸排阻的柱子，用于多糖的分析。

四、多糖純化分析的設備

? ? 多糖是由糖苷鍵結合的糖鏈，至少要超過10個以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，這類物質的一個顯著特點是幾乎都沒有紫外吸收，或者很弱，在檢測手段上有它的獨特方法。

表8.png

1、多糖純化系統針對多糖沒有紫外吸收的特點特別選配原裝進口Shodex示差折光檢測器和Rheodyne 7725i手動進樣閥，保證系統的靈敏度和穩定性。

2、輸液泵選配高精度柱塞泵，采用電子阻尼控制（Electrical Dump Control）和多點流量校正技術，有效控制流量脈動，保證最低基線噪聲和流量的精準。

設備特點：

表9.png

Part two 單糖和寡糖

??? 下面繼續把單糖和寡糖的分離純化也做個簡單的介紹。

糖類化合物的分析包括三個步驟，提取、純化和分析。在糖提取的步驟中，選擇水、稀釋的堿溶液和有機溶劑在不同的溫度下對糖樣品進行提取，提取溶劑的選擇需要根據目標成本的類型來確定。糖純化的過程可以使用萃取、分級沉淀、鹽析、衍生、酶解、水解、柱色譜（包括纖維素、離子交換樹脂、凝膠、HPLC法等）方法。糖分析中，最常用的方法是色譜分離（包括氣相色譜法、毛細管電泳和液相色譜法）并與合適的檢測技術聯用（包括紫外、示差、蒸發光散射、質譜和核磁共振等）。

??? 由于糖類的提取和純化都是類似的，前面做了詳細的介紹，所以單糖和寡糖的提取和純化步驟，這里就不再累述了，重點說說單糖和寡糖的高壓制備和HPLC分析。

一、高壓制備設備

表10.png

QuikSep 制備型中高壓層析系統根據流速范圍有50 ml/min至3000ml/min，根據客戶對產品制備量的要求，來選擇不同型號的系統。

1. QuikSep?系列純化系統秉承天然產物純化系統的所有優點，并根據合成產物的特性，要求大量、快速的處理樣品，因此在輸液泵選擇上選用流量更高的型號；
2、輸液泵單向閥選用特有的PTFE材料，對石油醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿等一些強有機溶劑耐受性更好，更適合正相體系！
二、單糖、寡糖類樣品制備填料的選擇----FUJI CHROMATOREX NH SG Silica Gel

迄今為止，大多數糖類的分離介質僅僅局限在分析級別，但是富士硅膠研發出用于制備色譜的新的氨基硅膠。當使用高水相為流動相時，一般的氨基填料會暴露出很多問題。氨基硅膠的pH值很高，一般pH為9.0，在這樣高的pH條件下，目標化合物一般都會變性，并且會毀壞硅膠基質的表面。考慮到這些問題，富士公司研發出新的氨基硅膠填料，稱之為NH SG硅膠。NH SG硅膠可以最小化甚至是避免上述問題，并且對糖類化合物進行更好的分離。

眾所周知，NH官能團會和酮或者羧基發生反應。但是，NH SG硅膠填料可以在有機相/水的流動相體積下分離大多數的糖類化合物，而不發生上述化學反應。NH SG硅膠在正相條件下使用，尤其是親水相互作用模式（HILIC）。作為典型的HILIC模式，在增加水相比例的條件下，洗脫增強。

1. 單糖和二糖的分離

表11.png