多糖的應(yīng)用現(xiàn)狀
近 20 年來,隨著天然藥物化學(xué)、藥理研究的不斷深入即分析手段突飛猛進(jìn)的發(fā)展,多糖的研究引起了國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者極大的興趣。研究表明, 多糖具有復(fù)雜的多方面的生物活性和功能,特別是對(duì)機(jī)體免疫功能的作用?，F(xiàn)在多糖已成為天然藥物及保健品研發(fā)中的重要組成部分。
作為藥物的多糖在治療腫瘤時(shí),不像一般化療藥物直接殺死生長(zhǎng)著的腫瘤細(xì)胞,而是促進(jìn)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),如激活補(bǔ)體、巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞或加強(qiáng)抗體生成等,以達(dá)到抑制和消滅腫瘤細(xì)胞的作用,對(duì)正常細(xì)胞影響很小。
例如：紫草和枸杞多糖具有抗突變、抗衰老和增強(qiáng)免疫功能的作用;枸杞多糖等可抵抗自由基過氧化；香菇、商陸、松果、柴胡和云芝多糖可激活巨噬細(xì)胞,從而抑制腫瘤生長(zhǎng);
從三七、防風(fēng)、甘草和刺五加中提取的多糖類化合物能激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),發(fā)揮抗腫瘤作用;
靈芝多糖通過活化巨噬細(xì)胞和蛋白激酶 C (PKC)而發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用等。目前,已有部分天然多糖類化合物用于臨床,顯示出良好的療效,多糖在治療腫瘤、代謝及感染性疾病等方面的應(yīng)用仍在不斷擴(kuò)大,給近代腫瘤、艾滋病及其他疾病的治療開辟了新的方向。
因此，許多學(xué)者也紛紛開始研究多糖，而多糖的分離純化也成為了研究多糖不可或缺步驟。選擇合適的分離純化多糖填料尤為重要。
多糖的分離方法
盡管多糖來源不同、品種繁多，但其分離純化的方法基本類似，主要是利用多糖溶于水或酸、堿、鹽溶液，而不溶于醇、醚、丙酮等有機(jī)溶劑的特點(diǎn)。提取時(shí)，一般應(yīng)先將植物原料脫脂和脫色素，然后以水為主體溶劑（如冷、熱或稀的酸、堿溶液）提取多糖。提取液以醇、丙酮等沉淀析出，所獲得的粗多糖需經(jīng)反復(fù)溶解與醇析。對(duì)于含糖多的苷類也可采用此法得到總苷。?
糖類提取之后需要進(jìn)一步除去大量的非糖雜質(zhì)，再進(jìn)行混合糖類的相互分離，這是一項(xiàng)比較困難的工作，尤其是多糖類難以獲得純品。一般可采用下列方法分離純化混合多糖。其中柱層析法是目前采用比較多的方法。
部分沉淀法
金屬鹽沉淀法
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提取液中加入中性醋酸鉛可沉淀去除大部分酸性、酚性的雜質(zhì)（如有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、樹脂酸、黃酮、蒽醌、鞣質(zhì)等），包括酸性多糖。而用堿式醋酸鉛對(duì)多糖的沉淀就更為完全。
除去雜質(zhì)后的母液用H2S脫鹽后，單糖、低聚糖和水溶性較大的中性苷類仍保留在濾液中。
鉛鹽沉淀法除去雜質(zhì)比較完全，母液脫鉛后可用于單糖和低聚糖的定量，也可用銅鹽沉淀法提取多糖。
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季銨鹽沉淀法
季銨類氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉淀，常用于分離酸性多糖。季銨氫氧化物與中性多糖不生成沉淀，但當(dāng)調(diào)高PH，使某些OH基解離，或加硼酸緩沖液增高糖的酸度，中性糖也能被沉淀。利用季銨氫氧化物在酸性、中性、微堿性、堿性中分級(jí)沉淀可以分離多糖。
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甲醇分級(jí)沉淀法
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常用的分級(jí)沉淀法是在混合多糖的濃水溶液中（常在PH=7時(shí)），逐步加入乙醇，收集不同醇濃度下析出的沉淀。一般各次沉淀需經(jīng)反復(fù)溶解后，再醇析，直到測(cè)得的物理常數(shù)恒定，最常用的是旋光度測(cè)定和電泳檢查。用分級(jí)沉淀法得到的多糖，常雜有較多的蛋白質(zhì)，必須予以去除。一般選擇那些使蛋白質(zhì)沉淀而使多糖不沉淀的試劑來處理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必須處理時(shí)間短，溫度低，避免多糖降解。
透析、超濾及超速離心
選用不同規(guī)格的超濾膜和透析帶進(jìn)行超濾和透析,以及一定條件下的超速離心操作,可按分子大小差異把多糖樣品分級(jí)。超濾和透析更常用于除去小分子物質(zhì)。?
制備性區(qū)域電泳
在電場(chǎng)作用下，不同的多糖按其分子大小、形狀及其所帶電荷的不同而達(dá)到分離。載體通常是玻璃粉。電泳完畢后，將玻璃粉載體推出柱外，分割后分別洗脫。此法分離效果較好，但只適于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模應(yīng)用。常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳、醋酸纖維塑膜電泳。
柱層析法
凝膠過濾層析
它是根據(jù)多糖分子的大小和形狀不同而達(dá)到分離的目的，已用于各種植物淀粉中直鏈和支鏈多糖的分離。常用的凝膠色譜分離材料主要有葡聚糖凝膠（sephadex G、sephadex LH-20）,瓊脂糖凝膠（sepharose）,纖維素凝膠（cellufine GCL-2000）,聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel P）等。
在色譜分離時(shí)，大分子的多糖比小分子先洗下來。對(duì)于分子量較大的多糖，選擇的sephadexG類對(duì)應(yīng)的凝膠型號(hào)一般為sephadex G-100、sephadex G-150、sephadex G-200，這些都屬于比較軟的一些凝膠（其中sephadex G-200由于太軟已經(jīng)停止生產(chǎn)），這時(shí)，可以考慮用CellufineGCL-2000代替，此填料的基材為纖維素，機(jī)械強(qiáng)度好，且它的分子量范圍較寬，比較適合多糖的分離。
離子交換層析
陰離子交換柱層析法是目前在多糖純化中應(yīng)用最普遍的一種方法,特別是對(duì)于體積較大的多糖溶液,大多數(shù)首先采用陰離子交換柱層析。通過柱層析,多糖溶液得到濃縮及初步純化(有的多糖通過該步驟即可得到各種均一多糖組分)。至今應(yīng)用的陰離子交換劑有DEAE-纖維素(DEAE-cellulose),DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephadex)及DEAE-瓊脂糖(DEAE-Sephadex) 3種,其中以DEAE-纖維素應(yīng)用得最為廣泛。DEAE-cellulose具有開放性的骨架,多糖能自由進(jìn)入載體中并進(jìn)行迅速擴(kuò)散。
陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性、中性多糖以及粘多糖。其分離機(jī)理不是單一的離子交換,而是吸附與解吸附,所以其不僅可應(yīng)用于中性多糖與酸性多糖的分離,也可應(yīng)用于不同中性多糖的分離。一般在pH值為6時(shí),酸性多糖能吸附于AIER上,中性多糖不吸附,然后用pH值相同、離子強(qiáng)度不同的緩沖液將酸性多糖分別洗脫下來,但如果柱為堿性(即OH-型),則中性多糖也能吸附。另外,某些多糖還能與硼酸形成絡(luò)合物,采用硼酸型AIER或硼酸溶液作流動(dòng)相,從而使糖類物質(zhì)能在AIER上進(jìn)行分離純化。如黃芪用水提取,經(jīng)Pb (OAC)2沉淀除去蛋白質(zhì),加乙醇可使多種糖沉淀出來。粗多糖再溶于水,通過硼酸型DEAE-纖維素柱,以.01mol/L硼砂溶液洗脫,再用乙醇、丙酮處理,可得黃芪多糖成分AG-1。其他黃芪多糖成分如AH-1和AH-2等,也用同樣的工藝進(jìn)行分離純化。吳亞林等通過DEAE-Sepharose fast flow陰離子交換層析得到純化的無花果多糖。
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